炎癥體NLRP3發揮作用的相關調控機制的論文
炎癥體的概念最早由 Martinon 等[1]提出，其來源主要是模式識別受體 （ pattern recognition receptors,PRRs） 中的核苷酸結合寡聚化結構域 （ nucleotide-binding oligomerization domain,NOD） 樣受體 （ NOD-like receptors,NLRs） 在活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 1 （ caspase-1） 過程中形成的大分子蛋白復合體，而該過程對白細胞介素 （ interleukin,IL） -1β 等促炎因子的成熟、分泌起到重要作用。目前發現的炎癥體包括 NLRP1、NLRP3、細胞質 DNA 傳感器黑色素瘤缺乏因子 （ absent in melanoma,AIM） 、白細胞介素轉換酶激活因子 （ interleukin-1β converting enzyme pro-tease-activating factor,IPAF） 等，其中以 NLRP3 研究最為深入。
NLRP3 炎癥體的組成與激活
NLRP3 炎癥體的組成 NLRP3 炎癥體主要由 NL-RP3 蛋白、caspase-1、凋亡相關點樣蛋白 （ apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC ）組成。NLRP3 蛋白的主要結構為核苷酸結合寡聚化結構域 （ nucleotide-binding oligomerization domain,NOD/NACHT） 及其 C-端的亮氨酸重復序列 （ leucine richrepeat,LRR ） 和 N-端 的 胱 天 蛋 白 酶 募 集 結 構 域（ caspase-activating and recruitment domain,CARD） 或熱蛋白結構域 （ pyrin domain,PYD）[2].caspase 家族主要與細胞凋亡和炎癥反應相關，作為 caspase 家族的一員，caspase-1 主要參與炎癥反應，其與促炎細胞因子 IL-1β 和 IL-18 前體的成熟、分泌密切相關，在NLRP3炎癥體促炎作用中發揮核心作用。ASC 主要結構包括與 NLRP3 蛋白連接的 PYD 和與 caspase-1 連接的 CARD.作為銜接蛋白的 ASC,其磷酸化在炎癥體激活過程中尤為重要，并且酪氨酸激酶 （ spleen tyro-sine kinase,SYK） 、c-Jun 氨基末端激酶 （ c-Jun N-ter-minal kinase,JNK） 能上調 ASC 的磷酸化[3].
NLRP3 炎癥體的激活 與 Toll 樣受體 （ Toll-likereceptor,TLR） 不同，NLRP3 主要在細胞內感受刺激呈遞信號[4].研究發現，多種外源性和內源性刺激物可激活 NLRP3 炎癥體，如脂多糖 （ lipopolysaccharide,LPS）[1]、尿 酸 結 晶 （ monosodium urate,MSU）[5]、ATP[6]、膽固醇結晶[7]、氧化低密度脂蛋白 （ oxidizedlow-density lipoprotein,ox-LDL）[8]等。關于其激活過程，目前認為可能與鉀離子流出機制[6]、活性氧 （ re-active oxygen species,ROS） 產生機制[9]和溶酶體損傷機制[10]有關。此外，NLRP3 炎癥體的激活還涉及TLRs 和核因子 κB （ nuclear factor-κB,NF-κB） 的相關通路[11].
NLRP3 炎癥體發揮作用的相關調控機制
氧化應激反應與 NLRP3 炎癥體的激活 氧化應激是指機體遭受各種刺激時體內氧化與抗氧化作用失衡，大量氧化產物堆積，導致機體損傷的一種病理過程，其中線粒體產生的 ROS 在氧化應激中發揮重要作用。近來研究發現，線粒體與 NLRP3 炎癥體的激活關系密切。多數研究認為，NLRP3 炎癥體激活是由線粒體與溶酶體相關作用介導的，且該過程主要與 ROS 的產生有關[12].如 ox-LDL 不僅在動脈粥樣硬化 （ ather-osclerosis,AS） 的發病過程中起到重要作用，而且能夠刺 激 NLRP3 炎 癥 體 的 激 活，該 過 程 需 依 賴ROS[13-14].在高半胱氨酸存在的腎小球損傷及硬化過程中，內源性的超氧化物 （ O2-） 、過氧化氫 （ H2O2）在 NLRP3 炎癥體的形成和激活中有重要作用[15].
Zhou 等[16]通過阻斷呼吸鏈上的關鍵酶 Complex I 和Complex Ⅲ的方法促進 ROS 的生成，并在人單核細胞型淋巴瘤 THP1 細胞培養上清液中觀察到 ROS 的產生與 IL-1β 的生成相關，而在敲除 NLRP3 或 caspase-1 基因的 THP1 細胞中應用呼吸鏈酶抑制劑后并未觀測到IL-1β 的分泌。為了更直接地確定線粒體在 NLRP3 炎癥體激活中的作用，其在隨后的'研究中采用阻斷與ROS 產生關系更為密切的電壓依賴型陰離子通道（ voltage-dependent anion channels,VDAC） 的方式，通過短 發 夾 RNA （ short hairpin RNA,shRNA） 沉 默VDAC 基因，再應用 MSU 等刺激物后，炎癥體的激活受到明顯抑制。在人骨髓間充質干細胞 （ human mar-row mesenchymal stem cells,hMSCs） 與巨噬細胞共培養的過程中，應用 LPS 或者 ATP 刺激巨噬細胞觀察NLRP3 炎癥體的激活情況，結果發現 hMSCs 可以分泌一種被稱為斯鈣素 （ stanniocalcin,STC） -1 的抗凋亡蛋白，它可以通過抑制 ROS 產生來阻止 NLRP3 炎癥體激活及 IL-1β 分泌[17].此外，吞噬細胞表達的兩種蛋白 S100A8 和 S100A9 可以通過 ROS 產生過程參與NLRP3 蛋白和 IL-1β 前體的表達[18].
另有不同觀點認為，NLRP3 炎癥體的激活并不一定依賴 ROS 的產生。惡唑烷酮類抗生素利奈唑胺可以不依賴 ROS 而激活 NLRP3 炎癥體，ROS 可能并不是直接在 NLRP3 炎癥體激活中發揮作用，而是對成熟后的 IL-1β 的外排過程起作用。但無論是否依賴 ROS,激活 NLRP3 的通路都與線粒體功能障礙相關，特別是與線粒體脂質雙磷脂酰甘油相關，其可能機制為線粒體脂質雙磷脂酰甘油可以直接與 NLRP3 結合組成聚合物來抑制 NLRP3 炎癥體的激活[19-20].因而有學者提出，線粒體參與 NLRP3 炎癥體激活的過程不僅是從ROS 產生途徑，還依賴于線粒體的整體功能[21].
內質網應激反應與 NLRP3 炎癥體的激活 內質網應激 （ endoplasmic reticulum stress,ERS） 在慢性炎癥類疾病的發生發展中起到重要作用，而其與炎癥相關性的具體機制仍不清楚。多種 ERS 誘導劑可以引起IL-1β 的分泌，其主要機制可能是 ERS 通過作用于NF-κB 信號通路，促進 IL-1β 前體物質的釋放并激活NLRP3 實現的[22].有研究顯示，在燙傷小鼠模型中注射 LPS 后，其肝臟組織中 NLRP3 炎癥體相關基因和ERS 相關基因蛋白表達量明顯增加[23].應用牛血清白蛋白刺激腎臟上皮細胞 （ NRK-52E） 可導致 NLRP3炎癥體的激活，同時表達的還有內質網標志物鈣網蛋白，而應用牛磺熊去氧膽酸 （ taurine-conjugated ur-sodeoxycholic acid,TUDCA） 使細胞對 ERS 適應性增加后可以抑制炎癥體激活，表明 ERS 在炎癥體的激活過程中發揮作用，增強細胞對 ERS 的適應性可以抑制炎癥體的激活，進而改善蛋白尿對腎上皮細胞的炎性損傷[24].X 盒結合蛋白 1 （ X-box-binding protein 1,XBP1） 是 ERS 反應的重要轉錄調控因子，是多種疾病的潛在治療靶點，相關研究顯示其可能通過內質網相關瞬時感受器電位鈣離子通道蛋白 1 （ transient re-ceptor potential calcium channel protein 1,TRPC1） 分泌的一種新的信號肽參與 NLRP3 炎癥體調節的 IL-1β/IL-18 的成熟及下游免疫反應過程[25].未折疊蛋白反應 （ unfolded protein response,UPR） 是 ERS 中的一條重要信號通路。有研究認為，硫氧還原蛋白相互作用蛋白 （ thioredoxin-interacting protein,TXNIP） 在 UPR中起重要作用，且 TXNIP 的產生依賴需肌醇酶 1α（ inositol requiring kinase1α，IRE1α） ,上調 TXNIP 表達水平有助于 NLRP3 炎癥體的激活[26].ERS 之所以能夠引起 NLRP3 炎癥體激活并促進促炎因子 IL-1β 釋放，可能與通過內質網起作用的促炎信號和 NLRP3 炎癥體激活的相關機制如 ROS 產生、鉀離子外流等過程關系密切，在發生 ERS 的細胞內，NLRP3 炎癥體可以感知并響應 ERS 下游信號，最終通過不同于 UPR 的不典型 ERS 反應，使得 ERS 與慢性炎癥相聯系[27].
另有相反的觀點認為，促炎因子 IL-1β 的成熟、分泌與 ERS 相關，但與 NLRP3 炎癥體無關。應用 LPS刺激巨噬細胞使其發生 ERS,發現 IL-1β 前體物質的成熟 在 ASC 蛋 白 缺 失 的 情 況 下 發 生，該 過 程 中caspase-8 起到重要作用，而 caspase-8 的激活又依賴TLR4 及其招募的 β 干擾 素 TIR 結構域銜接蛋白（ TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF） 信號分子，故認為 IL-1β 的成熟分泌與 NLRP3無關，而是通過 TLR4-ERS 相關通路調控[28].
自噬反應與炎癥體激活的相互調控 自噬在疾病中的作用越來越受到人們的關注，新近研究發現，NLRP3 炎癥體與自噬能夠相互調控。自噬可以雙向調控 NLRP3 炎癥體的激活。在大鼠胰島瘤細胞系 （ insu-linoma cell line,INS-1 ） 中，棕櫚酸 （ palmitic acid,PA） 可以誘導自噬，將含有自噬相關基因 7 （ autoph-agy-related 7,Atg7） 片段的質粒轉染入 INS-1 后，與對照組相比組織蛋白酶 B （ cathepsin B,CTSB） 、促炎因子表達均明顯增加； 在應用 siRNA 沉默 CTSB 后，IL-1β 等促炎因子表達減少； 沉默 NLRP3 基因后，與對照組相比 IL-1β 等促炎因子明顯減少，表明在 INS-1內自噬反應可以促進 NLRP3 炎癥體的激活，且該過程是通過過表達 CTSB 實現的[29].與此相反，在巨噬細胞離體實驗中，抑制自噬蛋白 LC3B 和 Beclin1 的表達后，在 LPS 或 ATP 刺激下 caspase-1、IL-1β/IL-18 的表達反而增加，進一步實驗證明適度自噬反應可以維持線粒體的完整性，進而抑制 NLRP3 炎癥體的激活[30].以上研究表明，自噬反應發生后對炎癥體激活是促進還是抑制似乎與自噬程度相關。此外，炎癥體激活后也可以促進或抑制自噬反應，但這種雙向調控的具體機制還不明確。通過激活炎癥體，尤其是NLRP3炎癥體，可以抑制線粒體自噬，影響線粒體的自我清除，進而對 AS 等疾病進展起到促進作用[31].
也有相反的研究顯示，NLRP3 炎癥體的激活可以促進自噬，應用 MSU 刺激骨母細胞 （ osteoblasts,OBs） 可以激活 NLRP3 炎癥體并誘導 NLRP3 依賴的自噬反應，同時 NLRP3 炎癥體還參與調控 OBs 內尿酸結晶-自噬體 （ MSU-autophagosomes） 的形成[32].
總結與展望
模式識別受體在先天性免疫中發揮重要作用，其參與的無菌炎癥等反應在多種代謝性疾病中的作用越來越受到人們的重視。AS 等代謝性疾病的發生是以炎癥反應為主要改變的復雜病理過程，而炎癥體作為紐帶將炎癥與氧化應激、ERS、自噬等病理過程相聯系，為更深入研究相關疾病的發病機制并發現可能的有效治療靶點提供了方向。但目前相關研究還有很大局限性，如線粒體與 NLRP3 炎癥體的激活關系是否通過 ROS 產生過程實現有待證實； 雖然多數研究肯定NLRP3炎癥體的激活與自噬作用相關，但炎癥體激活與自噬反應之間的雙向調控作用還有待進一步探討。總之，炎癥體相關調控機制可能為AS、糖尿病等代謝性疾病的防治提供新的方向，需要更為深入的研究。
參考文獻
[1] Martinon F,Burns K,Tschop PJ. The inflammasome: a mo-lecular platform triggering activation of inflammatory caspasesand processing of pro IL-β [J]. Mol Cell,2002,10 （ 2） :417-446.
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