植物基因工程課件
下面是小編搜集整理的植物基因工程課件，希望對(duì)大家有幫助！
植物基因工程課件
（1）植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件
（2）植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型和特性。
（3）植物基因工程載體的種類和特性
（4）根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能：T-DNA、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能。
（5）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機(jī)理
（6）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建
（7）載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記及報(bào)告基因
（8）根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化程序及操作原理
（9）外源基因在植物中的表達(dá)
了解植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型、特性掌握Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能，植物載體構(gòu)建原理，植物基因工程常用的載體類型。
重點(diǎn)
根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的原理和方法
難點(diǎn)
植物載體構(gòu)建原理
關(guān)鍵點(diǎn)
轉(zhuǎn)基因植物的獲取和檢測(cè)
教學(xué)目的和要求
教材分析
主要教具和設(shè)備材料
投影儀、電腦、常規(guī)教學(xué)設(shè)備板書與多媒體授課相結(jié)合
教法 思考題
1. 植物基因工程載體種類？
2. 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序？
心得
在自然界的許多雙子葉植物中，常常發(fā)生一種嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)的病害——冠癭。已知90多科，600多種雙子葉植物都能感染這種病。一般認(rèn)為單子葉植物和裸子植物對(duì)此病不敏感。70年代中期，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)誘發(fā)腫瘤的根癌農(nóng)桿菌中含有大量的誘瘤質(zhì)粒Ti(tumor-inducing plasmid),且證實(shí)了腫瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定地整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中的結(jié)果；由于其上載著的冠癭堿合成基因和激素合成基因表達(dá)，因此分泌冠癭堿并形成腫瘤。人們就把這種冠癭的形成過(guò)程稱作天然的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
農(nóng)桿菌將自身的DNA插入植物細(xì)胞誘發(fā)腫瘤只對(duì)其本身是有益的，重要原因之一是因?yàn)檗r(nóng)桿菌誘發(fā)植物細(xì)胞合成冠癭堿為自己提供食物。植物自身不能利用這種物質(zhì)，只能為它的合成付出代價(jià)，別的細(xì)菌也不能利用它，在自然條件下，只有農(nóng)桿菌能分泌分解冠癭堿的酶，將這些特異產(chǎn)物作為唯一的碳源和氮源來(lái)利用。
腫瘤的產(chǎn)生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)而產(chǎn)生腫瘤，這是T-DNA轉(zhuǎn)入的一個(gè)副產(chǎn)品。
Ti質(zhì)粒給自己設(shè)計(jì)出一套為其自身存活的非常優(yōu)秀的進(jìn)化格局：它感染植物細(xì)胞，使之出現(xiàn)愈傷組織增生，后者便產(chǎn)生出供帶有Ti質(zhì)粒的細(xì)菌用作能源、碳源和氮源的冠癭堿；而冠癭堿的產(chǎn)生又可激發(fā)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到原先沒有存在這種質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌中去，如此周而復(fù)始得到不斷發(fā)展。
Ti質(zhì)粒是一類理想的植物基因工程載體，通過(guò)它們可以將外源DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并再生出能夠表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。 Ti質(zhì)粒還具有若干其他載體所不具備的優(yōu)點(diǎn)：
（1）T-DNA能夠進(jìn)行高頻的轉(zhuǎn)移，而且這種轉(zhuǎn)移的DNA通常是以未發(fā)生變化的完整形式整合到植物的核基因組上。
（2）Ti質(zhì)粒不存在包裝限制問(wèn)題，大到50kb的外源DNA也能順利地包裝與轉(zhuǎn)移。
一、植物基因工程載體種類
據(jù)載體的功能和構(gòu)建過(guò)程，可把有關(guān)載體分為四大類型（九種載體）。 克隆載體、中間載體、卸甲載體、轉(zhuǎn)化載體
據(jù)載體的功能和構(gòu)建過(guò)程，可把有關(guān)載體分為四大類型，九種載體。
1、克隆載體（目的基因的克隆載體）
通常由多拷貝的E.coli小質(zhì)粒為載體 功能：保存和克隆目的基因。
2、中間載體又分為中間克隆載體和中間表達(dá)載體。
中間克隆載體：由大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DN段及目的基因、標(biāo)記基因等構(gòu)建而成。
功能：構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)。
分為：中間粘粒載體、質(zhì)粒粘粒愈合載體、基因標(biāo)記載體。 中間表達(dá)載體：含有植物特異啟動(dòng)子的中間載體
功能：作為構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。
3、卸甲載體
解除武裝的Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒。（onc+ -------- onc-） 功能：作為轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒
4、轉(zhuǎn)化載體
最后用于目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的載體，亦稱工程載體。 它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。
分為一元載體系統(tǒng)（順式載體）和雙元轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)（反式載體）。 一元載體系統(tǒng)包括共整合載體和拼接末端載體（SEV）。
二、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒
1、Ti質(zhì)粒的類型、結(jié)構(gòu)與功能
（1）類型
Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，分子量為95~156 x 106D，約150 ~ 200 Kb長(zhǎng)。根據(jù)其誘導(dǎo)的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)粒可分為三類： 章魚堿型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂堿型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58
農(nóng)桿堿型（agropine）和農(nóng)桿堿素型（agrocinopine）或琥珀堿型（succinamopine）
（2）結(jié)構(gòu)和功能
各種Ti質(zhì)粒都可分為四個(gè)區(qū)：
①T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions）：是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA。該DN段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。
②Vir區(qū)（Virulence region）：該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與vir區(qū)在質(zhì)粒上彼此相鄰，合起來(lái)約占Ti質(zhì)粒DNA的1/3。
③Con區(qū)（region of replication）：質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)編碼區(qū)，該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此，稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。
④Ori區(qū)（origin of replication）：該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，稱之為復(fù)制起始區(qū)。
3種成分與Ti質(zhì)粒腫瘤誘導(dǎo)有關(guān):
T-DNA：它可轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞，是一種可移動(dòng)因子。
毒性區(qū)：vir基因可產(chǎn)生轉(zhuǎn)移活動(dòng)蛋白，對(duì)增強(qiáng)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是必須的。 土壤農(nóng)癌桿菌染色體基因:間接參與轉(zhuǎn)化，負(fù)責(zé)將細(xì)菌細(xì)胞接合于植物上。
2、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)和功能
（1）T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 長(zhǎng)約23Kb
在T-DNA的5’和3’端都有真核表達(dá)信號(hào)，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。
T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復(fù)序列，即邊界序列，分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列（TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC）。通常右邊界序列更為保守，左邊界在某些情況下有所變化。左邊界的缺失突變?nèi)阅苤铝觯疫吔缛笔t不致瘤，這時(shí)幾乎完全沒有T-DNA的轉(zhuǎn)移，這說(shuō)明右邊界在T-DNA的轉(zhuǎn)移中的重要性。
胭脂堿型腫瘤，為一連續(xù)的一段序列，長(zhǎng)約23.4Kb，有腫瘤系，僅一個(gè)拷貝，有的T-DNA是多拷貝的。
章魚堿型腫瘤：T-DNA分左右兩部分（TL-DNA和TR-DNA），各自帶有左右邊界序列。左區(qū)的順序變化不大，長(zhǎng)度約13Kb，通常一個(gè)拷貝，但也有幾個(gè)拷貝首尾相連排列。含章魚堿合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA較短，長(zhǎng)約6-7Kb，拷貝數(shù)達(dá)數(shù)個(gè) 或數(shù)十個(gè)，有的腫瘤系中沒有TR-DNA。TR-DNA編碼5個(gè)基因，如甘露堿和冠癭堿合成酶基因。
（2）T-DNA上的編碼基因及功能
章魚堿型和胭脂堿型T-DNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同特點(diǎn)： T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈；
T-DNA上每個(gè)基因都有各自的啟動(dòng)子； 基因的轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞RNA聚合酶II完成；
T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號(hào)，在其5’端轉(zhuǎn)錄起始處有TATA和CAAT盒。另外，至少在5個(gè)T-DNA基因中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)8bp的相同順序（TTTCAA GA），同時(shí)AATAAA加尾信號(hào)也在同一條鏈上發(fā)現(xiàn)。
植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。 3、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能
毒性區(qū)的大多數(shù)基因產(chǎn)物都控制T-DNA的轉(zhuǎn)移，這個(gè)區(qū)域的突變往往導(dǎo)致農(nóng)桿菌感染植物能力的下降。
（1）Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)
章魚堿型Ti質(zhì)粒：Vir區(qū)大小為40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H（PinF）等8個(gè)操縱子，共24個(gè)基因。大多數(shù)操縱子含有多個(gè)基因VirA（1）、VirB（11）、VirC（2）、VirD（4）VirE（2）、VirF（1）、VirH（2）。
胭脂堿型Ti：有7個(gè)操縱子，少一個(gè)VirF，它們的第一個(gè)操縱子也不同，章魚堿型Ti是VirH，而胭脂堿型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir區(qū)基因的表達(dá)有兩種方式：
組成型表達(dá)；在無(wú)植物誘導(dǎo)分子存在下依然保持一定的表達(dá)水平，virA，virG、virH 誘導(dǎo)型表達(dá)：這些基因的表達(dá)必須在土壤農(nóng)桿菌感染植物時(shí)，在植物受傷組織分泌的信號(hào)分子作用下才能啟動(dòng)表達(dá)，如virB、C、D、E
virG雖屬于組成型表達(dá)，但有植物信號(hào)分子存在下表達(dá)量提高10倍，也具誘導(dǎo)表達(dá)特性。
（2）Vir區(qū)操縱子的基因的功能
①Vir A 單個(gè)基因，2.4kb，僅編碼一條多肽。Vir A編碼一種結(jié)合在膜上的化學(xué)受體蛋白（92KD），可直接對(duì)植物產(chǎn)生的酚類化合物感應(yīng)，是一種感應(yīng)蛋白。
Vir A的活化：當(dāng)AS與Vir A的受體部分結(jié)合后，會(huì)使整個(gè)Vir A蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，其C端活化。Vir A蛋白的胞質(zhì)區(qū)有自激酶的功能，可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，從而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有轉(zhuǎn)移其磷酸基至Vir G蛋白的一個(gè)宿存的天冬氨酸殘基的能力，使Vir G蛋白激活。
②Vir G Vir G ，只有1Kb，單基因，編碼DNA結(jié)合蛋白,其C端有DNA結(jié)合活性，N端具有磷酸化的酸性結(jié)構(gòu)。
從總體效應(yīng)講，Vir G基因是屬于組成型表達(dá)的，這對(duì)于細(xì)菌迅速地將外部環(huán)境信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)十分有利。
當(dāng)磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉(zhuǎn)到Vir G保守的天冬氨酸殘基上時(shí)，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二體或多體形式結(jié)合到Vir啟動(dòng)子的特定區(qū)，從而成為其它Vir 基因轉(zhuǎn)錄的激活因 子，打開Vir B、C、D、E、H等幾個(gè)基因。Vir A或G突變后會(huì)減弱或完全失去對(duì)其他Vir 位點(diǎn)活化的誘導(dǎo)，VirA及 Vir G 的這種調(diào)控作用被稱為雙因子調(diào)控體系。 ?Vir H、Vir F及Tzs
這些基因?qū)|(zhì)粒是特異的，在章魚堿型中有Vir F、Vir H，在胭脂堿型中有Tzs。
Vir H：對(duì)植物產(chǎn)生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使自身生不受抑制，可增強(qiáng)致瘤能力。
Vir F：編碼一個(gè)23KD蛋白，通過(guò)Vir 系統(tǒng)傳遞到植物細(xì)胞中，對(duì)T-DNA起運(yùn)輸作用。
Tzs：大部分胭脂堿型菌株的Ti質(zhì)粒上均有Tzs基因，轉(zhuǎn)運(yùn)玉米素合成酶基因，在細(xì)菌中表達(dá)后將玉米素分泌到細(xì)胞外。該細(xì)胞分裂素被植物吸收后，能促進(jìn)農(nóng)桿菌感染部位的植物組織脫分化和細(xì)胞分裂，提高植物對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的感受性。
三、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機(jī)理
1. T-DNA的加工及轉(zhuǎn)移
首先在下鏈25bp重復(fù)序列的右邊界左起第3和第4堿基間剪切，從缺口的3’端開始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22bp處。置換出原來(lái)的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。
VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分別編碼16KD和47KD蛋白，與T-DNA的加工有關(guān)，決定在邊界重復(fù)序列的特定位點(diǎn)上形成切口，產(chǎn)生T鏈斷裂。 VirD2蛋白的功能：①特異剪切，并與T鏈的5’端共價(jià)結(jié)合。②導(dǎo)向功能；
2.T鏈蛋白復(fù)合體的形成及VirE的功能
T鏈必須橫向跨越細(xì)菌細(xì)胞膜、細(xì)菌細(xì)胞壁、植物細(xì)胞壁、植物細(xì)胞膜及核膜才能整合進(jìn)植物基因組。
T鏈以一種DNA-蛋白復(fù)合體（T復(fù)合體）的形式存在。
目前已知至少兩種Vir特異蛋白即VirE2和VirD2與T鏈蛋白復(fù)合體的形成有關(guān)。
VirE2的功能：編碼ssDNA結(jié)合蛋白，該蛋白可非特異地一與任何ssDNA結(jié)合，通過(guò)與T鏈非共價(jià)結(jié)合，VirE2可包被T鏈形成細(xì)長(zhǎng)的核-蛋白絲，使ssDNA抗3’和5’外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。
3、T鏈復(fù)合體通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)及VirB的功能
（1）VirB的功能
VirB啟動(dòng)子有11個(gè)基因，大多數(shù)編碼跨膜蛋白或膜結(jié)合蛋白，能在膜上形成一種類似細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移時(shí)從供體菌轉(zhuǎn)至受體菌所必須的結(jié)構(gòu)——接合孔或性毛。T-DNA通過(guò)這種孔由細(xì)菌進(jìn)入植物細(xì)胞。同時(shí)，VirB也可能起運(yùn)輸和提供能量的作用。 按功能，可將VirB蛋白分成五類：
R：在內(nèi)膜上或內(nèi)膜內(nèi)的某些蛋白，可能作為T復(fù)合體的受體；
A：此類蛋白可能作為能源，作為一種ATP酶促進(jìn)T復(fù)合體被泵出細(xì)菌細(xì)胞，VirB11可能是這種A類蛋白。
C：形成通道的作用，如：VirB4是一種富集蛋白，無(wú)疏水區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，可能在T鏈轉(zhuǎn)運(yùn)中起一種結(jié)構(gòu)作用，形成至少一部分特殊的通道結(jié)構(gòu)。
S：載體蛋白，起運(yùn)載T 復(fù)合體穿過(guò)通道的作用，這類蛋白可能與所有膜成分（內(nèi)膜、外膜及周膜）有關(guān)。
P：位于外膜上，可能作為結(jié)合植物細(xì)胞膜的一種受體。
（2）T復(fù)合體向植物細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)
VirD2可能以一種極性方向，將T復(fù)合體定向至核孔，而VirE2則作為一種促進(jìn)因子，保證很長(zhǎng)的T復(fù)合體在進(jìn)入核孔時(shí)不受干擾。 在T-DNA轉(zhuǎn)移過(guò)程中，VirD2具有火車頭的作用，牽制T復(fù)合體以5’端到3’端的方向向核遷移，而VirE2則只助推器的角色，幫助未折疊的長(zhǎng)形T復(fù)合物不被打斷，并方便其向核運(yùn)動(dòng)。 已知VirE2-ssDNA可以抗拒內(nèi)切酶的作用，如核酸外切酶VII對(duì)VirE2-ssDNA降解能力將相當(dāng)于對(duì)ssDNA的6%，對(duì)S1核酸酶的效果也相似。
4、細(xì)菌染色體上與T-DNA轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因
目前已知農(nóng)桿菌染色體上有10個(gè)基因與T-DNA轉(zhuǎn)移有關(guān)，它們主要涉及細(xì)菌與植物細(xì)胞的接觸和細(xì)菌向植物傷口的趨化性。
chvE——編碼一個(gè)葡萄糖和半乳糖結(jié)合蛋白，主要結(jié)合組成植物細(xì)胞壁的單糖；可能由于識(shí)別植物受傷產(chǎn)生的糖單體，導(dǎo)致細(xì)菌向植物傷口的趨化性；在低pH值、磷酸饑餓條件下啟動(dòng)VirG表達(dá)。
chvD——編碼一種細(xì)菌ATP結(jié)合蛋白，在低pH值、磷酸饑餓條件下誘導(dǎo)VirG蛋白含量升高，然后VirA接受AS信號(hào)，刺激VirG轉(zhuǎn)化成活性形式，啟動(dòng)其他VirG 基因表達(dá)。
chvA 、chvB、 chvC——與環(huán)狀?-1，2-葡聚糖的合成和運(yùn)輸有關(guān)； chvB產(chǎn)物催化合成葡聚糖， chvA產(chǎn)物將多糖從胞質(zhì)運(yùn)到胞外，影響農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的附著能力。
pscA和Exoc——與多糖的合成有關(guān)，并影響農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的附著能力。
四、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建
1、野生型Ti質(zhì)粒直接作為基因工程載體的障礙：
（1）分子量大，160~240Kb；
（2）有各種限制性內(nèi)切酶的多個(gè)切點(diǎn)；
（3）T-DNA區(qū)中含有許多編碼基因與基因轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，如致瘤基因，其存在還會(huì)導(dǎo)致植物體喪失形態(tài)發(fā)生能力；
（4）Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制。
2、Ti質(zhì)粒構(gòu)建的幾個(gè)重要因素
（1）右邊界序列；
（2）完整的Vir基因群；
（3）有獨(dú)特的酶切點(diǎn)；
（4）有在植物中可表達(dá)的選擇性基因；
（5）有在細(xì)菌中可表達(dá)的選擇性基因；
（6）章魚堿型農(nóng)桿菌品系需要獨(dú)特的增強(qiáng)子。
3、載體構(gòu)建
先將T-DN段克隆到大腸桿菌質(zhì)粒中，并插入外源基因，最后通過(guò)三親交配或接合轉(zhuǎn)
移把外源基因引入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上。
Ti質(zhì)粒的載體系統(tǒng)分兩類：一元載體和雙元載體
例：雙元載體的構(gòu)建
雙元載體系統(tǒng)由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容質(zhì)粒構(gòu)成。
（1）構(gòu)建原理
Ti質(zhì)粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，T-DNA和Vir區(qū)處于不同的Ti質(zhì)粒上同樣能起到轉(zhuǎn)移T-DNA的作用。
雙元載體含有廣泛寄主范圍質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（oriv），從而代替了在共整合載體中用以重組的同源區(qū)，它們能在任何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復(fù)制。所以寄主僅需一套完整的vir質(zhì)粒就可。主要的轉(zhuǎn)移區(qū)載在小重組Ti質(zhì)粒上。
（2）微型Ti質(zhì)粒（mini-Ti plasmid）
含有T-DNA邊界，缺失Vir基因的質(zhì)粒；含廣譜質(zhì)粒的復(fù)制位點(diǎn)OriV及選擇標(biāo)記基因。
（3）輔助Ｔｉ質(zhì)粒
含Vir區(qū)段的Ti質(zhì)粒，helper Ti,是T-DNA缺失的突變型Ti（卸甲Ti），提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。
LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生質(zhì)粒)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更強(qiáng)的毒性。
五、根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞的機(jī)理
1、根癌農(nóng)桿菌的生物學(xué)特性
分類
農(nóng)桿菌屬，也稱土壤桿菌屬和根瘤菌屬，是同屬于根瘤科的革蘭氏陰性菌。
土壤桿菌屬有4 個(gè)種：根癌農(nóng)桿菌、放射形農(nóng)桿菌、毛根農(nóng)桿菌和懸鉤子農(nóng)桿菌。
根癌農(nóng)桿菌，根據(jù)其誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生的冠癭堿種類不同可分為三種類型即章魚堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型。
生活習(xí)性
土壤桿菌屬都是土壤習(xí)居菌，主要生活在曾被多種植物生活過(guò)的土壤中，好氧，但也能在低氧壓的植物組織中生長(zhǎng)，最適溫25~30℃，pH4.0~12.0,最適pH6.0~9.0。 形態(tài)結(jié)構(gòu)
農(nóng)桿菌細(xì)胞呈桿形，0.8x1.5~3.0μm,以1~4根周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢，菌落無(wú)色，隨菌齡增加，光滑的菌落逐漸變成有條紋，但也有許多菌株生成的菌落呈粗糙型。 寄主范圍
根癌農(nóng)桿菌廣泛存在于雙子葉植物中，根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約有93屬643種雙子葉植物對(duì)根癌農(nóng)桿菌敏感。裸子植物對(duì)該菌同樣具敏感性，能誘發(fā)腫瘤，對(duì)絕大多數(shù)單子葉植物無(wú)侵染能力。
2、根癌農(nóng)桿菌侵染的誘導(dǎo)信號(hào)及作用機(jī)理
（1）酚類化合物
酚類物質(zhì)——農(nóng)桿菌浸染植物細(xì)胞所必需的誘導(dǎo)物，同時(shí)將其作為趨化物來(lái)識(shí)別。 實(shí)驗(yàn)證明，一些植物中常見的酚類化合物的混合物都可激活Vir區(qū)基因。如：兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、β-羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草醛。
Stachel等在煙草葉片的傷口誘出液中確認(rèn)了兩種主要的Vir區(qū)基因誘導(dǎo)物：乙酰丁香酮AS和羥基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可誘導(dǎo)Vir活化。
（2）中性糖和酸性糖
中性糖在Vir基因誘導(dǎo)和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS誘導(dǎo)條件下，
發(fā)現(xiàn)許多中性糖（L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔羅糖、2-脫氧-D-葡萄糖）都可增強(qiáng)一些Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)。這些中性糖是通過(guò)chvE和VirA起作用，chvE編碼葡萄糖和半乳糖結(jié)合蛋白，識(shí)別傷口產(chǎn)生的糖單體，導(dǎo)致農(nóng)桿菌的趨化作用。
酸性多糖是組成植物細(xì)胞壁中果膠質(zhì)的主要成分。最近的實(shí)驗(yàn)證明，酸性糖（胡蘿卜根提取物中蒸餾出來(lái)）可改變農(nóng)桿菌基因的表達(dá)。蛋白質(zhì)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，至少有10種蛋白質(zhì)合成被其誘導(dǎo)，一種被阻遏。
（3）pH值
5.0~5.5的低pH值。誘導(dǎo)物對(duì)pH的要求是<.6.0, 在農(nóng)桿菌培養(yǎng)在含有酚類化合物（AS）的培養(yǎng)基中時(shí)，pH5.0 ~5.8Vir的誘導(dǎo)達(dá)到一個(gè)最高水平
3、根癌農(nóng)桿菌的侵染能力及其特異性
（1）常用的根癌農(nóng)桿菌
胭脂堿型（Nop）菌株：染色體背景為C58，生長(zhǎng)快，不結(jié)球，轉(zhuǎn)化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。
章魚堿型（Oct）菌株：染色體背景為Ach5，生長(zhǎng)慢，結(jié)球，轉(zhuǎn)化中難操作，培養(yǎng)后不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。
農(nóng)桿堿型（Agr）菌株，也稱琥珀堿型（Suc）：染色體背景為A281或A136，具有胭脂堿型菌株的特點(diǎn)，以A136為染色體背景的常用菌株是EHA101，生長(zhǎng)快，不結(jié)球，侵染能力強(qiáng)，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。
（2）、根癌農(nóng)桿菌的侵染能力差異
根據(jù)侵染能力大小將農(nóng)桿菌分為：
廣宿主菌株：大多數(shù)雙子葉、若干裸子植物、少量單子葉植物；如：pTiB0542、pTiA6； 窄宿主菌株：有限的幾種植物上誘發(fā)腫瘤，如pTiAg162,僅能在葡萄的幾個(gè)品種上誘發(fā)腫瘤。 不同植物對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性不同，在轉(zhuǎn)化中，二者的選配十分重要，要選農(nóng)桿菌與植物之間有高侵染力的配合。如：楊樹莖，用C58優(yōu)于LBA4404；蘋果，6種基因型比較，葉：EHA101（pEHA101）優(yōu)于LBA4404，C58；莖：A281優(yōu)于C58，ACH5，A348。
農(nóng)桿菌的染色體背景對(duì)宿主范圍同樣有著重要作用。因?yàn)槌齎ir區(qū)功能外，農(nóng)桿菌對(duì)植物表面識(shí)別與結(jié)合有關(guān)的功能還取決于農(nóng)桿菌染色體上基因位點(diǎn)。農(nóng)桿菌所展示出不同的生長(zhǎng)速率、多糖產(chǎn)生和對(duì)植物細(xì)胞的毒力都會(huì)影響轉(zhuǎn)化率和宿主范圍。
六、根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序及操作原理
1、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基本程序
（1） 選擇適宜的培養(yǎng)基，使創(chuàng)傷部位能產(chǎn)生盡可能多的再生植株。
（2） 確定供體植物最適的培養(yǎng)條件。
（3） 確定最佳外植體類型、大小、部位等：再生途徑，愈傷組織起源（細(xì)胞類型、層次），
保證轉(zhuǎn)化愈傷組織和芽原基由創(chuàng)傷部位的淺層細(xì)胞發(fā)育而來(lái)。
（4） 確定適宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，還能保證愈傷組
織正常生長(zhǎng)和分化。
（5） 確定選擇壓力的最低水平。
（6） 優(yōu)化農(nóng)桿菌接種和共培養(yǎng)條件改進(jìn)篩選條件，促進(jìn)抗性細(xì)胞恢復(fù)再生能力：采用無(wú)毒的生化物質(zhì)。
2、根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、純化、保存及工程菌液的制備
（1）農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
常用的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基有 LB、 YEM、 YEB、 TY、 523、PA及 MinA等培養(yǎng)基。
這些培養(yǎng)基中，LB、YEB、YEM及523屬富集培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，包括有各種有機(jī)成分。在這些培養(yǎng)基中農(nóng)桿菌生長(zhǎng)快，分裂旺盛，它們是常用 制備工程菌液的培養(yǎng)基。 ? PA和 TY培養(yǎng)基是屬營(yíng)養(yǎng)較好的培養(yǎng)基，氨基酸及碳源、氮源都很豐富。農(nóng)桿菌在這些培養(yǎng)基上生長(zhǎng)也很快，是常用的農(nóng)桿菌選擇培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基。
MinA培養(yǎng)基與前幾種培養(yǎng)基有明顯差異：只提供必要的無(wú)機(jī)鹽，并用葡萄糖和（NH4）2SO4 提供碳源和氮源。
Minimal只用相應(yīng)的冠癭堿如 NOpaline、 Octopine等取代蔗糖、氨基酸和無(wú)機(jī)氮作為農(nóng)桿菌的碳源和氮源。
農(nóng)桿菌在MinA和Minimal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢。在進(jìn)行三親雜交時(shí)通常用這兩種培養(yǎng)基，并加相應(yīng)的抗生素選擇轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。含重組質(zhì)粒的大腸桿菌及含輔助質(zhì)粒 pRK20 13的HB101因不能利用冠癭堿作為碳源和氮源而不能生長(zhǎng)，同時(shí)還存在抗生素的選擇，因此有利于選擇轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。
農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)周期
農(nóng)桿菌培養(yǎng)方式：分為固體平板培養(yǎng)和液體振蕩培養(yǎng)，
固體培養(yǎng)一般需2～3d，液體培養(yǎng)生長(zhǎng)更快，一般需1～2d。
農(nóng)桿菌接種在培養(yǎng)液后，并不立即開始增殖。一般在25～30℃時(shí)，需1～2 h細(xì)菌才開始分裂。
當(dāng)生長(zhǎng)開始后，細(xì)菌數(shù)目以一恒定的指數(shù)速率倍增，直至培養(yǎng)基成分改變和供氧缺乏時(shí)才停止增殖。當(dāng)細(xì)菌增長(zhǎng)速率達(dá)到對(duì)數(shù)指數(shù)時(shí)稱之為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。
當(dāng)細(xì)菌密度達(dá)到 177／ml時(shí)，空氣中的氧氣便難以很快地?cái)U(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)。在振蕩或通氣條件下培養(yǎng)，細(xì)菌濃度也很少超過(guò) 2～3 X 109／ml。
測(cè)定農(nóng)桿菌濃度的方法：最簡(jiǎn)單的方法是光密度測(cè)定法。將菌液裝入比色杯汽在分光光度計(jì)上選用600nm波長(zhǎng)測(cè)定其OD值。光密度與濃度換算公式是1OD約等于 8 X 108／ml。
（2）工程菌的純化
純化菌種的方法主要采用常規(guī)的微生物純化方法，即劃線法。用接種針劃線，然后用石蠟?zāi)し饪冢瑢⑵矫蟮怪梅藕銣叵鋬?nèi)，在25～28℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，次日或即日看到分離的單菌落。挑取單菌落接種在液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)。
（3）工程菌侵染懸浮液的制備
液體振蕩培養(yǎng)的工程菌，通常培養(yǎng) 12～24 h后即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用離心管取一定數(shù)量的菌液進(jìn)行4000r／min離心，倒掉上清液，再加入植物外值體誘導(dǎo)愈傷組織或分芽的液體培養(yǎng)基，使其光密度OD值達(dá)到0．5，即可用作接種外植體的工程菌液。
注意：因?yàn)檗r(nóng)桿菌培養(yǎng)基中通常含有抗生素，它對(duì)外植體的生長(zhǎng)、脫分化或分化有不良影響，放需通過(guò)離心除去細(xì)菌培養(yǎng)基，加入植物培養(yǎng)基。也有的做法是，將農(nóng)桿菌加入植物培養(yǎng)基后再振蕩培養(yǎng) 12 h，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后再離心，倒掉上清液，用新的植物液體培養(yǎng)基稀釋至一定OD值，再作為工程菌液使用。
（4）工程菌的`保存
菌種的保存的目的是創(chuàng)造一個(gè)適合細(xì)菌休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧），使其得以長(zhǎng)期保存。其功能在于盡量減少菌株的傳代次數(shù)；使菌種經(jīng)保存后不死亡、不污染雜菌，并保持其原有性狀，降低菌種的變異率；最終目的是的基因不能丟失。
菌種保存的方法根據(jù)其保存時(shí)間長(zhǎng)短可分為三種方法：
短期保存〔數(shù)月）：采用斜面或平板保存法。斜面菌種置于4℃可保存數(shù)月，平板用石蠟?zāi)っ芊夂笠部稍诘蜏?～4℃下放置數(shù)月。
中長(zhǎng)期保存（數(shù)年）：中長(zhǎng)期保存采用穿刺法，這是一種菌種接入柱狀培養(yǎng)基的方法。經(jīng)常應(yīng)用的是半固體柱狀培養(yǎng)基，用接種針沾取少量問(wèn)后直接插入柱狀培養(yǎng)基中。需注意的是，要從培養(yǎng)基中間插入，直插到接近管底，但不要穿透培養(yǎng)基，再慢慢按原途徑拔出接種針，切勿攪動(dòng)，以免使接種線不整齊而影響觀察，甚至?xí)蛴昧噭?dòng)造成空隙太大進(jìn)入空氣，而影響保存效果。穿刺培養(yǎng)的菌種用蠟封口，在室溫下可保存數(shù)年。
長(zhǎng)期保存菌種：主要采用甘油保存法。在7％二甲基亞（DMSO）或 15％甘油中，菌種可于- 70℃冰箱或液氮中長(zhǎng)期保存。當(dāng)甘油含量增加40～ 50%時(shí)，細(xì)菌可在- 20℃或- 70℃條件下，保存若干年而不失活。將冰凍菌種從冰柜中取出時(shí)，應(yīng)當(dāng)放在冰浴上慢慢融化，不可直接將其放室溫下，否則會(huì)導(dǎo)致菌體失活，更不能直接接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)28℃振蕩培養(yǎng)。
3、Vir基因活化誘導(dǎo)物的使用
（1）誘導(dǎo)物：
常用誘導(dǎo)物是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（OH－AS），其中效果優(yōu)是AS。但最近又有新的發(fā)現(xiàn)，有兩種特殊化合物比AS的誘導(dǎo)活性高10～100倍。
（2）誘導(dǎo)物的使用方法
在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)時(shí)加 AS，加入時(shí)間－般在制備工程菌浸染液使用前4～6 h加入。使農(nóng)桿菌既處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，又處于vir基因高度活化狀態(tài)，從而提高侵染能力。也有的在農(nóng)桿菌懸浮液離心后用植物外植體培養(yǎng)基稀釋成侵染液時(shí)加入。
AS加在農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。共培養(yǎng)的過(guò)程是Ti質(zhì)粒實(shí)現(xiàn) T-DNA轉(zhuǎn)化時(shí)期。一般農(nóng)桿菌附著 16 h后才能進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這時(shí)需要vir基因的高度活化。因此，許多科學(xué)家贊成這種使用方法。
在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中及共培養(yǎng)基中都加入AS。這種方法似乎最牢靠，只不過(guò)是使用的AS誘導(dǎo)劑太多了。
（3）誘導(dǎo)物使用的pH值
pH值對(duì)vir區(qū)的活化有著明顯的影響，從理論上講含AS的培養(yǎng)基pH值為5．0～5．6時(shí)， Vir區(qū)基因的誘導(dǎo)達(dá)到最高水平。
pH值改變 0．3，即對(duì)多種植物的轉(zhuǎn)化率有明顯影響。
章魚堿型和農(nóng)桿堿型菌系比胭脂堿型和琥珀堿型需要更低的pH值。
通常農(nóng)桿菌培養(yǎng)時(shí)pH值為7．2。這種生長(zhǎng)旺盛的菌株的vir基因均處于不活化狀態(tài)。而組織培養(yǎng)基中的pH值常為5．8，有利于vir基因的活化。在vir基因活化誘導(dǎo)中應(yīng)調(diào)整培養(yǎng)基的pH值。
4、外植體的選擇
Mayer等指出，轉(zhuǎn)化只發(fā)生在細(xì)胞分裂的一個(gè)較短的時(shí)期內(nèi)，可能只有處于細(xì)胞分裂周期的S期才具有外源基因的轉(zhuǎn)化能力，因?yàn)楹嘶蚪MDNA正在復(fù)制時(shí)才能使外源DNA整合。因此細(xì)胞具有分裂能力是轉(zhuǎn)化的基本條件。
（1）外植體的種類
葉片、葉柄、子葉、子葉柄、下胚軸、莖、花莖、匍匐莖、塊；莖尖分生組織、芽、根、合子胚或體細(xì)胞胚，以至成熟的種子等都可作為外植體轉(zhuǎn)化。但各種外植體材料的轉(zhuǎn)化率有明顯差異。
最佳共培養(yǎng)的時(shí)間：
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，并不“侵入”到植物細(xì)胞中去，而是把T－DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，這一段時(shí)間稱為“細(xì)胞調(diào)節(jié)期”。因此，共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于 16h。共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，由于農(nóng)桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)，植物細(xì)胞因受到毒害而死亡。共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率有著很大影響，而且不同物種、外植體種類、農(nóng)桿菌菌株的最佳共培養(yǎng)時(shí)間不同。
確定最佳共培養(yǎng)時(shí)間的方法主要采用gus基因瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定法，即共培養(yǎng)后定時(shí)測(cè)定外植體的gus基因顏色反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)瞬時(shí)表達(dá)率及表達(dá)面積，以表達(dá)率高，表達(dá)面積大為優(yōu)。同時(shí)還要考慮外植體的受損害程度，以保證外植體的旺盛生長(zhǎng)為直。最后還要以獲得的轉(zhuǎn)化愈傷組織頻率或轉(zhuǎn)化不定芽頻率為最終依據(jù)。
農(nóng)桿菌的增殖適度
在共培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌增殖生長(zhǎng)不良，外植體切口邊緣只有很少的農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，則轉(zhuǎn)化的機(jī)率很小。反之，農(nóng)桿菌在外值體四周過(guò)度增殖，可引起對(duì)外植體的毒害，致使其褐化死亡。 控制農(nóng)桿菌增殖適度的原則是既要使菌株在外植體邊緣特別是切口面旺盛增殖生長(zhǎng)，又不應(yīng)過(guò)度，一般以覆蓋切口面為適度。 控制農(nóng)桿菌增殖的方法有以下幾種：
1）調(diào)整工程菌液的濃度，生長(zhǎng)太快則應(yīng)降低菌液濃度。
2）控制共培養(yǎng)時(shí)間，農(nóng)桿菌的增殖生長(zhǎng)適度也是確定共培養(yǎng)最佳時(shí)間的指標(biāo)，共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)可造成農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)。
3）使用抗生素調(diào)控農(nóng)桿菌的增殖生長(zhǎng)。一種方法是在共培養(yǎng)基中加入適量的抗生素如羧芐青霉素或頭孢霉素。另一種方法是共培養(yǎng)2～3d后的外植體需用含抗生素的液體共培養(yǎng)基充分洗滌，以除去過(guò)量的農(nóng)桿菌，然后轉(zhuǎn)到新鮮的共培養(yǎng)基上繼續(xù)共培養(yǎng)。共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)若仍存在農(nóng)桿菌過(guò)度增殖，則可再用上述洗滌培養(yǎng)基充分洗滌后進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽分化培養(yǎng) 。 共培養(yǎng)中激素的影響
共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中是否加激素，文獻(xiàn)報(bào)道不一，有的不加激素，有的則認(rèn)為加激素后促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂，保持細(xì)胞活力，也有利于轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而提高轉(zhuǎn)化率。
如 Mansur等（1993）用 A281菌株與花生葉片外植體共培養(yǎng)時(shí)，加激素比不加激素的腫瘤誘導(dǎo)率提高約 30％。
目前大多數(shù)研究者采用加激素的方法，而且共培養(yǎng)基與愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。
（4）外植體脫菌及選擇培養(yǎng) 外植體的脫菌培養(yǎng) 脫菌培養(yǎng)，即把共培養(yǎng)外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素的培養(yǎng)基上。常用的脫菌抗生素有羧芐青霉素（Carb）、 頭孢霉素（Cef） 等。這些抗生素不僅對(duì)農(nóng)桿菌有殺傷或抑菌作用，而且對(duì)植物細(xì)胞同樣有一定的生物效但對(duì)不同植物的不同外植體產(chǎn)生的影響不同。
Holford 等（1 992 ）指出，Carb 的分解物為生長(zhǎng)素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈傷組織的增殖。Howe 等（ 1994 ）觀察到對(duì)楊樹的愈傷組織誘導(dǎo)有抑制作用。在甘藍(lán)研究中發(fā)現(xiàn)，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化階段需用Carb， 生根階段則用Cef。 抗生素的使用濃度一般為500mg／L 左右。其使用原則是在達(dá)到抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的目的后，盡量降低其濃度。
脫菌培養(yǎng)的時(shí)間：脫菌培養(yǎng)的時(shí)間，一般需5～6次繼代培養(yǎng)，但仍然不能把殘留的農(nóng)桿菌殺死，特別是共生在維管束和細(xì)胞間隙中的農(nóng)桿菌。如果停止使用抗生素后的外植體又有農(nóng)桿菌可再使用抗生素脫菌。也有的植物一直使用抗生素，直到試管苗形成。
（5）轉(zhuǎn)化體的選擇培養(yǎng)
?選擇壓： 選擇抗生素如 Km，加入選擇培養(yǎng)基后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生一種選擇作用，
稱之為選擇壓。加入的抗生素濃度愈大，選擇壓也愈大。選擇培養(yǎng)基中抗生素的濃度，即選擇壓的強(qiáng)度，也要根據(jù)植物的特性而定，較敏感的植物要用較低的 Km濃度。一般濃度范圍是 Km 50～ 100mg／L， hpt 10~20mg／L， ppt 5～20mg／L。
?選擇的方法：前期選擇、延遲選擇和后期選擇。
前期選擇：就是外植體共培養(yǎng)后，在轉(zhuǎn)入愈傷組織或不定芽誘導(dǎo)的一開始就加入選擇壓，相當(dāng)于前面講到的先選擇后再生。
延遲選擇：當(dāng)愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)開始不加選擇壓，過(guò)一周或一定時(shí)間后再加入選擇壓，這樣既有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)又不會(huì)產(chǎn)生更多的嵌合體 后期選擇：即相當(dāng)于前面說(shuō)的先再生后選擇，有利于提高轉(zhuǎn)化率。
選擇培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)化和再生細(xì)胞的一致性
在選擇培養(yǎng)條件下再生細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否一致，關(guān)系到能否得到真正的轉(zhuǎn)化，只有同時(shí)具有再生和轉(zhuǎn)化潛力的細(xì)胞才有可能分化成轉(zhuǎn)基因植株。因此再生部位和可被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞部位應(yīng)該發(fā)源一致，反之得到的可能是假轉(zhuǎn)化體。假轉(zhuǎn)化體在繼代選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良而死亡，或呈白化。
七、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法
1、整體植株接種共感染法
該途徑是模仿農(nóng)桿菌天然的感染過(guò)程，人為地在整體植株成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷面上，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植株體內(nèi)，桿菌在植株體內(nèi)進(jìn)行侵染實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，因此也稱之為體內(nèi)轉(zhuǎn)化。為了獲得更高的轉(zhuǎn)化頻率，一般采用無(wú)菌的種子實(shí)生苗或試管苗。它是最簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)化法。
優(yōu)點(diǎn)：
實(shí)驗(yàn)周期短；
充分利用了這些無(wú)菌實(shí)生苗的生長(zhǎng)潛力；避免在轉(zhuǎn)化中其他細(xì)菌的污染；菌株接種的傷口與培養(yǎng)基分離，以免農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上過(guò)度生長(zhǎng)，允許在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基上進(jìn)行；
具有較高的轉(zhuǎn)化成功率。
缺點(diǎn)：
轉(zhuǎn)化組織中常混有較多未轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞，即形成嚴(yán)重的嵌合體； 需要大量的無(wú)菌苗材料； 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選比較困難。
2、葉盤轉(zhuǎn)化法
（1）葉盤法轉(zhuǎn)化的操作
打孔器從消毒葉片上取得葉圓片
葉盤在過(guò)夜培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌的菌液中浸數(shù)秒種后，置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng) 待菌株在葉盤周圍生長(zhǎng)至肉眼可見菌落時(shí)再轉(zhuǎn)移到含有抑菌劑的培養(yǎng)基中除去農(nóng)桿菌。
同時(shí)在該培養(yǎng)基中加入抗生素進(jìn)行轉(zhuǎn)化體選擇，3~4周培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)化的再生植株。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、適用性廣 （2）轉(zhuǎn)化苗的保持與繁殖
主要采用兩條途徑實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化苗的保持與繁殖。
營(yíng)養(yǎng)繁殖途徑，它包括試管苗的無(wú)性快速繁殖及嫁接、扦插等田間的無(wú)性繁殖方式。 該途徑保持繁殖轉(zhuǎn)化苗時(shí)應(yīng)注意如下：
①正確使用激素濃度，低水平的激素能有利于保持外植體活力，并刺激休眠側(cè)生分生組織的發(fā)育及側(cè)枝形成。適當(dāng)提高分裂素濃度有利于芽的分化，形成原始轉(zhuǎn)化苗的無(wú)性系克隆。因此可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇細(xì)胞分裂的濃度。
②為消除殘留的農(nóng)桿菌在繁殖培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素是明智的種子繁殖：
這對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株的正常表達(dá)、遺傳特性及向生產(chǎn)化過(guò)渡具有重要作用。該途徑的主要操作是將轉(zhuǎn)化試管苗在小花盆中移栽成活，然后轉(zhuǎn)入田間，開花時(shí)套袋隔離防止雜交授粉及向環(huán)境中釋放轉(zhuǎn)化的花粉。結(jié)種后注意收割種子，保存。
3、原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化方法
（1）操作步驟：
①?gòu)娜~片分離原生質(zhì)體，在26t下暗培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)移到2000lX下繼續(xù)培養(yǎng)48h；
②在細(xì)胞即將分裂，新的細(xì)胞壁物質(zhì)已經(jīng)形成時(shí)，加入活化的農(nóng)桿菌懸浮液。農(nóng)桿部原生質(zhì)體的比例以1：1000左右為宜。共培養(yǎng)約2～3 d；
③再加入選擇標(biāo)記的抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇培養(yǎng)約3～4周后可產(chǎn)生肉眼可見的小塊轉(zhuǎn)化愈傷組織；
④將小塊愈傷組織轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上再生愈傷組織，此時(shí)繼續(xù)保持選擇壓力，以便保證只有轉(zhuǎn)化愈傷組織才能不斷生長(zhǎng)；
⑤將轉(zhuǎn)化愈傷組織轉(zhuǎn)入固體分化培養(yǎng)基，獲得轉(zhuǎn)化再生植株。其他步驟與葉盤法相同。
（2）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)及一些技術(shù)問(wèn)題原生質(zhì)體的密度一般以105～106個(gè)／ml為宜。
在農(nóng)桿菌和原生質(zhì)體共培養(yǎng)期民農(nóng)桿菌附著在原生質(zhì)體上，超過(guò)32小時(shí)之后方可除菌洗滌，也就是要有一定的附著時(shí)間。
原生質(zhì)體出現(xiàn)新形成的細(xì)胞壁物質(zhì)是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的基本條件，這是因?yàn)榧?xì)胞壁物質(zhì)與農(nóng)桿菌的附著有關(guān)。未形成新細(xì)胞壁物質(zhì)的原生質(zhì)體沒有農(nóng)桿菌的附著，也沒有轉(zhuǎn)化進(jìn)行。 在共培養(yǎng)過(guò)程中，某些二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+）為農(nóng)桿菌的附著和轉(zhuǎn)化所必需。二價(jià)離子的整合物EDTA可以抑制農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞壁的吸附及轉(zhuǎn)化作用，因?yàn)樯鲜?Mg2+（不是 Ca2+）與農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞壁有關(guān)。 共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化似乎是在單細(xì)胞或二細(xì)胞階段發(fā)生，因此獲得的轉(zhuǎn)化愈傷組織大部分是來(lái)自一個(gè)細(xì)胞。
八、 癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的評(píng)述
優(yōu)點(diǎn)：
成功率高，效果好。該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是模仿或稱之為利用天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，不管是用菌株接種整體植物的傷口，還是直接侵染離體培養(yǎng)細(xì)胞，通常都可以獲得滿意的轉(zhuǎn)化頻率。
在所有的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是機(jī)理研究得最清楚的，方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛。
Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)可以容納相當(dāng)大的DN段插入，目前已把長(zhǎng)達(dá)50kb的異源DNA序列通過(guò)T－DNA完整地轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。
T－DNA上含有引導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移和整合的序列，以及能夠被高等植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別的功能啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄信號(hào)，使插入到T-DNA區(qū)的外源基因能夠隨同T-DNA一道在植物細(xì)胞中表達(dá)。
可根據(jù)人們的需要連接不同的啟動(dòng)子，使外源基因能夠在再生植株的各種測(cè)器官中特異性表達(dá)，例如在果實(shí)中表達(dá)，在葉中表達(dá)，甚至僅在根中表達(dá)，即可進(jìn)行人為地控制。
農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律，因此轉(zhuǎn)基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料。
缺點(diǎn)：根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)作為一個(gè)植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的不足之處是它主要用于雙子葉植物，如何擴(kuò)大其應(yīng)用范圍如禾谷類、裸子植物等，一直是人們所關(guān)心問(wèn)題。
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